作者：藥鏈圈

基因藥物通常由含工程化基因構(gòu)建體的載體或遞送系統(tǒng)組成,其活性成分可為DNA?RNA?基因改造的病毒?細(xì)菌或細(xì)胞,通過(guò)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織,替代?補(bǔ)償?阻斷?修正特定基因,以達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的?；蛩幬锸钱?dāng)今最前沿的藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域之一，在治療遺傳病、癌癥、，預(yù)防傳染病等方面正不斷取得突破性進(jìn)展，主要包括遺傳病治療病毒、溶瘤病毒、基因編輯、mRNA藥物、小核酸藥物等，本文將重點(diǎn)對(duì)基因編輯進(jìn)行介紹。

圖：主要基因藥物類型

什么是基因編輯

基因編輯是一種新興的能夠較為精確的對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)?；蚓庉嫻ぞ呤且粋€(gè)由序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的序列特異性核酸內(nèi)切酶，基因編輯的過(guò)程可以概括為一找、二剪、三修補(bǔ)，識(shí)別染色體上的DNA靶位點(diǎn)（找），進(jìn)行切割并產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（剪），誘導(dǎo)DNA的損傷修復(fù)（修補(bǔ)），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)指定基因組的定向編輯。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，基因編輯就是利用一個(gè)經(jīng)過(guò)改造的蛋白作為工具，對(duì)指定的基因進(jìn)行定向改造。

基因編輯發(fā)展歷史

在基因編輯誕生前，基因工程技術(shù)經(jīng)歷了四十余年的發(fā)展歷程。從1953年，美國(guó)的沃森和英國(guó)的克里克提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的分子模型開(kāi)始，人類就已經(jīng)踏上了破解生命奧秘旅程；上世紀(jì)六十年代，科學(xué)家通過(guò)射線轟擊植物，引發(fā)了植物遺傳基因的隨機(jī)突變，培育出各種新表現(xiàn)型植物物種。到了七十年代，轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi)始蓬勃發(fā)展，1973年，科學(xué)家成功將抗生素基因片段插入到細(xì)菌當(dāng)中，第一個(gè)基因工程生物由此誕生。1974年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠問(wèn)世，為藥物開(kāi)發(fā)臨床前研究做出了重要貢獻(xiàn)。這十年間針對(duì)基因工程技術(shù)應(yīng)用的監(jiān)管體制也開(kāi)始不斷完善。到了八十年代和九十年，基因工程技術(shù)開(kāi)始廣泛應(yīng)用于制藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。1982年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)基因工程人類藥合成胰島素上市。1983年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Klug在非洲爪蟾體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了鋅指蛋白——ZFP，13年后這種蛋白被用于第一代基因編輯技術(shù)。1987年，科學(xué)家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)短規(guī)律性間隔重復(fù)序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，即后來(lái)的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列——CRISPR，因其高度保守性，當(dāng)時(shí)科學(xué)家猜測(cè)其一定具有重要的生物學(xué)功能。1994年Calgene推出第一個(gè)基因工程食物Flavr Savr番茄，這種番茄插入了防止腐爛的基因，使得番茄可以長(zhǎng)久保持新鮮。1996年，孟山都公司開(kāi)始推出一系列經(jīng)過(guò)基因改造的農(nóng)作物,并受到了市場(chǎng)歡迎。

九十年代末至今的二十余年間，基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了三代發(fā)展。1996年，科學(xué)家開(kāi)始探索第一代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)——鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)，但直到2002年，也僅在小鼠和果蠅等少數(shù)模式生物中實(shí)現(xiàn)了同源重組介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯，且因同源重組的效率很低，限制了其應(yīng)用前景。 2007年科學(xué)家在發(fā)現(xiàn)了植物病原體-黃單胞菌中的轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物-TALEs，同年Horvath研究組首次驗(yàn)證CRISPR能在細(xì)菌的免疫功能中起作用。2010年第二代基因編輯技術(shù)——轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）誕生。2012年，科學(xué)雜志將TALENs技術(shù)列入了年度十大科學(xué)突破列表，同年，維也納的Emmanuelle Charpentier教授與加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna教授揭示了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的工作機(jī)制。隨后第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas開(kāi)始迅速發(fā)展，2013年張鋒等人將CRISPR/Cas系統(tǒng)成功應(yīng)用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，很快人們利用CRISPR/Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚(yú)、真菌及細(xì)菌的基因編輯。2016 年，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤中心胸部腫瘤科主任盧鈾教授團(tuán)隊(duì)使用 CRISPR 技術(shù)編輯非小細(xì)胞肺癌患者 T 細(xì)胞 PD-1 基因的首個(gè)人類 I 期臨床試驗(yàn)開(kāi)始。2017年，Sangamo開(kāi)展了全球首例人體內(nèi)基因編輯治療。44歲的Brian Madeux患有先天新陳代謝異常疾病亨特綜合癥，成為第一個(gè)在體內(nèi)進(jìn)行基因編輯的人，通過(guò)靜脈注射，將數(shù)十億矯正基因及一個(gè)能精準(zhǔn)位置并切斷原有DNA的基因編輯工具注入他體。

圖：Brian Madeux接受ZFNs基因編輯治療

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2019年，中科院的科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作的基因敲除猴。在CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)明以前，制作基因敲除的靈長(zhǎng)類幾乎是不可想象的事情。

圖：全球首例基因敲除猴

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2020年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授因在CRISPR基因編輯技術(shù)中的卓越貢獻(xiàn)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

圖：2020諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主

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2020年3月4日，張鋒創(chuàng)立的Editas Medicine公司宣布：CRISPR療法AGN-151587（EDIT-101）治療先天性黑蒙癥10型（LCA10）的I/II期臨床試驗(yàn)，已完成首例患者給藥。這是全球首個(gè)人體內(nèi)CRISPR基因編輯臨床試驗(yàn)，此次也是全球首例CRISPR基因編輯的在體給藥。

圖：EDIT-101作用原理

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主要基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

第一代基因編輯技術(shù)——ZFNs技術(shù)

ZFNs（鋅指核酸酶）技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白（ZFP）發(fā)展起來(lái)的。ZFNs由特異性識(shí)別序列的鋅指蛋白(ZFP)和FokI核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識(shí)別域能識(shí)別DNA的特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由FokI構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細(xì)胞可以通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù)DNA。HR修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。

圖：ZFNs作用原理

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第二代基因編輯技術(shù)——TALENs技術(shù)

TALENs（轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物）是繼ZFNs之后的另一種較為靈活和高效的靶向編輯技術(shù)，TALENs在結(jié)構(gòu)上與ZFNs類似，是由特異性的DNA結(jié)合蛋白-TALE蛋白和FokⅠ核酸酶兩部分組成。TALE蛋白是植物病原體-黃單胞菌分泌的一種轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物，是一類分泌蛋白，在植物細(xì)胞中能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合寄主靶基因的序列，從而調(diào)控寄主的基因表達(dá)。進(jìn)行基因編輯時(shí)，兩個(gè)TALE蛋白識(shí)別和結(jié)合DNA靶位點(diǎn)，F(xiàn)okⅠ核酸酶負(fù)責(zé)對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，從而造成DNA的DSBs，誘發(fā)細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶位點(diǎn)的編輯。

TALENs的合成與組裝相對(duì)于ZFNs要簡(jiǎn)單和靈活，其關(guān)鍵是要合成TALE蛋白串聯(lián)重復(fù)區(qū)的編碼DNA序列，理論上將多個(gè)TALE重復(fù)單元編碼的DNA序列通過(guò)多次連接即可實(shí)現(xiàn)，但是要合成這種高度重復(fù)序列也具有一定的困難和挑戰(zhàn)。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種快速、簡(jiǎn)便合成和組裝TALENs方法，如Golden gate (GG)組裝法、快速高通量固相合成法等。

圖：TALENs作用原理

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第三代基因編輯技術(shù)——CRISPR-Cas技術(shù)

CRISPR-Cas技術(shù)是基于原核生物(細(xì)菌和古生菌)一種免疫系統(tǒng)而開(kāi)發(fā)的，稱之為Clustered regularly interspaced short palindro- mic repeats-CRISPR-associated proteins (規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)及其相關(guān)蛋白)，簡(jiǎn)稱CRISPR-Cas系統(tǒng)。由于該技術(shù)合成簡(jiǎn)單、周期短、操作靈活、效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前備受人們關(guān)注。CRISPR-Cas工作原理如下1. sgRNA與Cas蛋白結(jié)合，形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物2. RNP復(fù)合物在sgRNA的引導(dǎo)下，定位到基因組上的靶位點(diǎn)。3. Cas蛋白會(huì)識(shí)別原間隔基序(protospacer adjacent motif，簡(jiǎn)稱 PAM)，對(duì)靶位點(diǎn)的DNA雙鏈進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。4. DSB引起細(xì)胞的緊急修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)或者同源重組修復(fù)（HDR）5. 絕大多數(shù)情況下（>80%），細(xì)胞采用NHEJ修復(fù)路徑，使得靶位點(diǎn)位置隨機(jī)產(chǎn)生個(gè)別堿基的刪除或插入（Indel），得到基因敲除模型。6. 極少數(shù)情況下（<20%），且細(xì)胞內(nèi)存在同源片段時(shí)，細(xì)胞采用HDR修復(fù)路徑，使得靶位點(diǎn)產(chǎn)生精確修復(fù)。7. 在同源片段中引入外源基因片段或者突變堿基，可得到基因定點(diǎn)插入模型或者基因定點(diǎn)突變模型

圖：CRISPR/Cas9作用原理

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三種基因編輯技術(shù)的比較

作為革命性的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas的優(yōu)勢(shì)非常明顯，相較于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas的設(shè)計(jì)難度和構(gòu)建難度都要小的多，成本更低，開(kāi)發(fā)周期更短，靶向修飾效率更高，此外CRISPR/Cas還具有可以多靶點(diǎn)編輯和可以編輯RNA的優(yōu)勢(shì)，這是前兩種技術(shù)所不具備的。但是CRISPR/Cas有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，如果靶基因附近沒(méi)有PAM則無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的編輯。ZFNs技術(shù)作為開(kāi)發(fā)時(shí)間最久的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)積累了大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在應(yīng)用于藥物研發(fā)方面更為成熟。

圖：三種基因編輯技術(shù)比較

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